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Proimmune
產(chǎn)品時間：2020-05-16
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掌握免疫
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嵌合A2KbPro5®MHC I類五聚體
轉(zhuǎn)基因小鼠模型已成為評估假定的人類抗原疫苗接種的重要工具。HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠表達結(jié)合了HLA-A * 02：01的alpha-1和alpha-2結(jié)構(gòu)域與H-2Kb的alpha-3結(jié)構(gòu)域的修飾的I類MHC分子。
為了研究在這種小鼠中的細胞毒性T細胞免疫應(yīng)答，已經(jīng)提出可以使用嵌合的A2Kb多聚體以便準(zhǔn)確地檢測相關(guān)的免疫應(yīng)答。
生物素標(biāo)記的Pro5®Pentamers和Pro5®Biotag
生物素標(biāo)記的五聚體的多種應(yīng)用
生物素標(biāo)記的Pro5®MHC I類五聚體允許枚舉和分離抗原特異性CD8 + T淋巴細胞。多聚體MHC-肽復(fù)合物結(jié)合特定特異性的T細胞受體（TCR），如MHC等位基因和肽組合所確定的。可以通過流式細胞術(shù)分析用生物素標(biāo)記的Pro5®Pentamers染色的CD8 + T細胞，然后用熒光鏈霉親和素偶聯(lián)物染色，以確定抗原特異性T細胞的頻率。
通過使用鏈霉親和素包被的磁性微珠，生物素標(biāo)記的五聚體也可以用于分離或消除抗原特異性CD8 + T細胞。如果需要獲得活細胞用于進一步分析，例如T細胞培養(yǎng)或基因表達譜分析，則以這種方式分離抗原特異性T細胞非常有用。生物素標(biāo)記的五聚體也可用于基于板的測定（如ELISA）中，可將其固定在鏈霉親和素包被的表面上。
Pro5®Biotag是一種生物素標(biāo)簽蛋白，可與未標(biāo)記的Pro5®Pentamers特異性結(jié)合，可作為輔助試劑用于流式細胞儀分析。可以通過流式細胞術(shù)分析用五聚體加Pro5 Biotag結(jié)合選擇的熒光標(biāo)記的鏈霉親和素綴合物染色的CD8 + T細胞，并確定抗原特異性T細胞的頻率。因此，將Biotag與未標(biāo)記的五聚體一起使用可提高實驗靈活性，并增強Pentamer染色的應(yīng)用能力。
應(yīng)用：流式細胞術(shù)
可以通過流式細胞術(shù)分析用生物素標(biāo)記的五聚體與選擇的熒光標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合物染色的CD8 + T細胞，以確定抗原特異性T細胞的頻率。多種與鏈霉親和素結(jié)合的熒光染料可與生物素標(biāo)記的五聚體一起使用，從而在多通道流式細胞儀染色實驗中增加了靈活性。
下圖顯示了示例性染色，其中使用B * 08：01 / RAKFKQLL（EBV BZLF-1）特異性生物素標(biāo)記的Pentamer，然后用SA-PE，SA-PerCP或SA染色1 x 106個外周血細胞-PE Cy5。即使每個熒光標(biāo)記的熒光強度都不相同，也可以實現(xiàn)相似程度的抗原特異性染色。
應(yīng)用：分離T細胞
使用生物素標(biāo)記的五聚體與鏈霉親和素包被的順磁珠結(jié)合，可以輕松分離或清除抗原特異性CD8 + T細胞。ProImmune的生物素標(biāo)記五聚體適用于任何微珠系統(tǒng)和微珠供應(yīng)商，這意味著它們可與現(xiàn)有試劑和設(shè)備一起使用。如果需要獲得活細胞用于進一步培養(yǎng)或分析（例如表達譜分析），則以這種方式分離抗原特異性T細胞很有用。
下圖顯示了使用B * 08：01 / RAKFKQLL（EBV BZLF-1）特異性生物素標(biāo)記的Pentamer從外周血懸浮液中清除抗原特異性細胞的過程。將原始細胞群（耗盡前）和分離后（耗盡后）上清液的樣品與抗CD8-FITC抗體和SA-PE孵育，以觀察抗原特異性細胞。抗原特異性種群從1.53％減少到0.04％，證實了EBV BZLF-1細胞的珠分離成功。
應(yīng)用：培養(yǎng)細胞的擴增
人工抗原呈遞已經(jīng)成為刺激和擴增培養(yǎng)細胞的重要工具。生物素標(biāo)記的五聚體可與>2μm鏈霉親和素標(biāo)記的順磁珠偶聯(lián)，并與共刺激抗體（如生物素化的抗CD28和抗CD40抗體）結(jié)合使用，以在體外刺激單個抗原特異性T細胞。
應(yīng)用：免疫分析
可以將生物素標(biāo)記的五聚體固定在任何抗生蛋白鏈菌素包被的表面上，以用于體外測定，例如基于板的ELISA。五聚體特別適用于該實驗平臺，因為分子的擴展方向結(jié)構(gòu)意味著提供/提供了高拷貝數(shù)的MHC分子。
在下圖中，用A * 02：01特異性生物素標(biāo)記的Pentamer的系列稀釋液包被了96孔ELISA板。通過加入抗A * 02：01構(gòu)象抗體，然后加入抗小鼠Ig-HRP和TMB（3,3'，5,5'–四甲基聯(lián)苯胺），可以觀察結(jié)合的五聚體。在450nm處讀取板，并且該圖顯示了五聚體濃度相對于吸光度。
ELISA固定化生物素化的Pro5®MHC I類五聚體
通訊協(xié)定
生物素標(biāo)記的Pro5®MHC Pentamer的細胞染色方案（2層染色）
所需材料
洗滌緩沖液（0.1％疊氮化NA，0.1％BSA的PBS溶液），固定液（1％胎牛血清，2.5％的甲醛的PBS溶液），對所選抗原具有特異性的生物素標(biāo)記的Pro5®Pentamer，熒光標(biāo)記的鏈霉親和素綴合物，抗CD8抗體（與鏈霉親和素偶聯(lián)物的熒光不同）。
每個染色條件分配1-2 x 10 6個淋巴樣細胞（PBMC或脾細胞）。（ 由于抗原特異性T細胞的頻率高，使用T細胞克隆或品系時，每個染色條件只能分配2-5 x 10 5個細胞）。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，并將其重懸于剩余體積（?50μl）中。
每個染色條件添加一個測試（10μl）生物素標(biāo)記的五聚體。
在室溫下孵育10 – 15分鐘。
用10倍體積的洗滌緩沖液洗滌細胞。
每個染色條件添加jia滴定量的熒光標(biāo)記的鏈霉親和素和抗CD8抗體。
在黑暗中于冰上孵育2030分鐘。
將細胞在洗滌緩沖液中洗滌兩次，并在黑暗中保存在固定溶液中。
現(xiàn)在，細胞已準(zhǔn)備好進行流式細胞儀分析。通過先在活淋巴樣細胞上進行門控，然后在雙色圖上進行分析，在X軸上顯示CD8，在y軸上顯示Pentamer，可以方便地查看Pentamer陽性細胞。
未標(biāo)記的Pro5®MHC Pentamer plus Biotag的細胞染色方案（三層染色）
所需材料
洗滌緩沖液（0.1％疊氮化na，0.1％BSA的PBS溶液），固定液（1％胎牛血清，2.5％的甲醛的PBS溶液），針對所選抗原的未標(biāo)記Pro5®Pentamer，Pro5®Biotag，熒光標(biāo)記的鏈霉親和素偶聯(lián)物，抗CD8抗體（與鏈霉親和素偶聯(lián)物的熒光不同）。
每個染色條件分配1-2 x 10 6個淋巴樣細胞（PBMC或脾細胞）。（ 由于抗原特異性T細胞的頻率高，使用T細胞克隆或品系時，每個染色條件只能分配2-5 x 10 5個細胞）。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，并將其重懸于剩余體積（?50μl）中。
每個染色條件添加一個測試（2μl）未標(biāo)記的五聚體。
在室溫下孵育10 – 15分鐘。
用10倍體積的洗滌緩沖液洗滌細胞。
添加一個測試（8μl）Pro5®Biotag。
在冰上孵育2030分鐘。
每個染色條件添加jia滴定量的熒光標(biāo)記的鏈霉親和素和抗CD8抗體。
在黑暗中于冰上孵育2030分鐘。
將細胞在洗滌緩沖液中洗滌兩次，并在黑暗中保存在固定溶液中。
現(xiàn)在，細胞已準(zhǔn)備好進行流式細胞儀分析。通過先在活淋巴樣細胞上進行門控，然后在雙色圖上進行分析，在X軸上顯示CD8，在y軸上顯示Pentamer，可以方便地查看Pentamer陽性細胞。
磁珠隔離協(xié)議
所需材料
洗滌緩沖液（0.1％疊氮化na，0.1％BSA的PBS溶液），抗生蛋白鏈菌素珠（例如，來自Polymer Labs的Lodestars 2.7抗生蛋白鏈菌素；來自Dynal Biotech的Dynabeads M-280抗生蛋白鏈菌素）。為了獲得jia結(jié)果，少應(yīng)使用1 x 10 7個 淋巴樣細胞（PBMC或脾細胞）。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，并重懸于200ml洗滌緩沖液中。
每2 x 10 6個 細胞添加1個測試（10μl）生物素標(biāo)記的Pentamer 。
在室溫下孵育10分鐘。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，然后重懸于500μl洗滌緩沖液中。
加入適量的鏈霉親和素珠子（建議每細胞少5個珠子）。
在冰上混合孵育30分鐘。
用洗滌緩沖液將試管中的體積增加2 ml，然后放入磁性顆粒分離器中。
靜置3-5分鐘。如果需要，可以保留上清液用于流式細胞儀分析，以確認(rèn)已去除抗原特異性細胞。
用洗滌緩沖液洗滌含珠細胞復(fù)合物的部分3次，棄去上清液。
分離的珠細胞復(fù)合物可置于細胞培養(yǎng)物中，珠子應(yīng)在幾天后解離。
固體表面固定方案
所需材料
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），鏈霉親和素，0.1M碳酸氫鈉（NaHCO3），Tween-20，牛血清白蛋白（BSA）。
通過在0.1 M NaHCO3（pH 8.2）中于4ºC孵育過夜，以100 ng /孔的抗生蛋白鏈菌素（100μl/孔的96孔ELISA板）覆蓋固體表面（例如ELISA板）。
用PBS / 0.05％Tween-20清洗表面3次。
用5％BSA / PBS（200μl/孔的96孔ELISA板）封閉，并在室溫下孵育1小時。
用PBS / 0.05％Tween-20清洗表面3次。
加入50ng /孔生物素標(biāo)記的Pentamer（或根據(jù)需要滴定），并在室溫下孵育1小時。
用PBS / 0.05％Tween-20清洗表面3次，然后進行所需的測定。
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