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運動蛋白資源目錄
運動蛋白質(zhì)類
真核驅(qū)動蛋白運動蛋白利用ATP水解的能量沿著細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)移動貨物，如染色體和小泡[1]。它們在細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)膸缀跛蟹矫娑及l(fā)揮著重要作用，并參與廣泛的生理過程，包括胚胎發(fā)育[2]、軸突運輸[3]和細(xì)胞分裂[4]。。。（點擊此處了解更多關(guān)于運動蛋白的信息）。
運動蛋白質(zhì)常見問題
問題1：如何使用驅(qū)動蛋白進(jìn)行藥物篩選？
答案1：動蛋白運動蛋白利用微管（MT）作為底物，在細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)各種動力學(xué)事件。它們已經(jīng)被證明可以沿著MT軌道運送染色體和血管等貨物。驅(qū)動蛋白通過水解利用ATP的能量來發(fā)揮作用，這種活性在MT存在的情況下會大大增強(qiáng)。為了篩選調(diào)節(jié)運動蛋白和MT之間相互作用的藥物，MT激活的驅(qū)動蛋白ATP酶測定可以用作驅(qū)動蛋白的MT激活的ATP酶活性的測試。細(xì)胞骨架開發(fā)了兩種這樣的測定法，一種是終點測定法，另一種是動力學(xué)測定法，可用于發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化驅(qū)動蛋白調(diào)節(jié)劑。兩種測定都測量由微管激活的驅(qū)動蛋白三磷酸腺苷（ATP酶）活性產(chǎn)生的無機(jī)磷酸鹽（Pi）水平。這兩種驅(qū)動蛋白-ATP酶生物化學(xué)分析試劑盒（Cat.#BK053和BK060）提供MT和驅(qū)動蛋白重鏈（KHC）蛋白以及必要的緩沖液和試劑，以測量Pi的產(chǎn)生，作為篩選調(diào)節(jié)驅(qū)動蛋白和/或MT功能相互作用的藥物的手段。這些試劑盒可用于發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白抑制劑和激活劑（Cat.#BK053和BK060）以及測定驅(qū)動蛋白運動蛋白的Vmax和Kcat值（Cat.#BK060。
問題2：有哪些試劑盒可用于表征推定的運動蛋白？
答案2：運動蛋白利用微管作為底物，這意味著運動蛋白是微管相關(guān)蛋白（MAP）的一種類型。為了證實推定的運動蛋白與微管結(jié)合，可獲得Cytoskeley的微管結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)下降測定試劑盒（Cat.#BK029）。待評估的蛋白質(zhì)需要通過考馬斯藍(lán)或銀染色或用蛋白質(zhì)本身的抗體或與蛋白質(zhì)綴合的標(biāo)簽（his、myc等）進(jìn)行可視化。不可水解的ATP類似物，例如AMPPNP，通常以5或10mM使用以維持微管附著。微管還激活運動蛋白的ATP酶活性，這可以用我們的驅(qū)動蛋白ATP酶測定法之一（Cat.#BK053或BK060）來測量。這些試劑盒可用于發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白抑制劑和激活劑（Cat.#BK053和BK060）以及測定驅(qū)動蛋白運動蛋白的Vmax和Kcat值（Cat.#BK060。Cytoshelle，股份有限公司還提供Biochem試劑盒（Cat.#BK027），其允許使用熒光標(biāo)記的微管可視化運動蛋白運動。
技術(shù)支持
時間：周一至周五，山地標(biāo)準(zhǔn)時間上午8點至下午5點
Cytoskeley的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊提供無與比的服務(wù)和支持，讓您與擁有開發(fā)和測試我們在現(xiàn)場實驗室創(chuàng)建的分析、試劑盒和試劑第一手經(jīng)驗的科學(xué)家取得聯(lián)系。您可以上述號碼致電我們的技術(shù)服務(wù)小組，或通過上述電子郵件地址以電子方式提交您的問題。問題通常會在一個工作日內(nèi)通過電話或電子郵件回復(fù)。還請務(wù)必查看我們的常見問題解答、技術(shù)提示和其他產(chǎn)品信息，這些信息可以通過產(chǎn)品類別或目錄號訪問。
運動蛋白質(zhì)
Cytoskeley Motor-Werks™（CMW）產(chǎn)品線由Cytoskelle家生產(chǎn)和銷售。這些產(chǎn)品促進(jìn)了運動蛋白領(lǐng)域的研究和藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)展（Funk等人，2005）。我們專注于生產(chǎn)高純度和生物活性的真核生物和真菌來源的驅(qū)動蛋白和肌球蛋白家族蛋白。這些試劑用于抗有絲分裂藥物的發(fā)現(xiàn)和運動活性的機(jī)制研究。Cytoskeley Motor-Werks™生產(chǎn)線還包含幾種Biochem試劑盒™、抗體和其他與運動相關(guān)的試劑（如微管穩(wěn)定劑紫醇，Cat.#TXD01）和蛋白質(zhì)（如預(yù)形成的微管，Cat.#MT002）。
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概述
真核驅(qū)動蛋白運動蛋白利用ATP水解的能量沿著細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)移動貨物，如染色體和小泡[1]。它們在細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)膸缀跛蟹矫娑及l(fā)揮著重要作用，并參與廣泛的生理過程，包括胚胎發(fā)育[2]、軸突運輸[3]和細(xì)胞分裂[4]。許多驅(qū)動蛋白在細(xì)胞分裂中的重要作用，以及驅(qū)動蛋白的過度表達(dá)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等癌癥有關(guān)[5]，使它們成為抗有絲分裂癥發(fā)展的非常有吸引力的靶點。觀察到許多驅(qū)動蛋白僅在細(xì)胞分裂過程中表達(dá)，這也表明它們可能優(yōu)于目前的抗有絲分裂藥物靶點，如普遍表達(dá)的微管蛋白[6，7]。
Kinesins的一般結(jié)構(gòu)
所有驅(qū)動蛋白的標(biāo)志是存在一個保守的~340個氨基酸的運動結(jié)構(gòu)域[8]。這個領(lǐng)域分為兩個主要部分。第一部分是催化核心區(qū)，由催化ATP水解的ATP結(jié)合位點[9]和將馬達(dá)束縛在MT軌道上的微管（MT）結(jié)合位點[10]組成。第二部分是約10-40個氨基酸的頸部區(qū)域，被認(rèn)為有助于單向運動[11]。在球狀運動結(jié)構(gòu)域之外，存在一個α-螺旋卷曲螺旋區(qū)，參與蛋白質(zhì)的同源和異源寡聚，最常見的是以同源二聚體的形式存在。這個區(qū)域被稱為莖[8]。柄通常將運動域與稱為尾部的第二個球狀域分開。尾部域被認(rèn)為與貨物綁定有關(guān)。
Kinesin分類與結(jié)構(gòu)多樣性
迄今為止，從酵母（釀酒酵母含有6種驅(qū)動蛋白）、真菌到人類（目前有13種驅(qū)動肽[12]），已經(jīng)在生物體中鑒定出約150種驅(qū)動素。分類基于運動域同源性，特別是在特定類別的頸部和鄰近區(qū)域[12]。目前人們一致認(rèn)為驅(qū)動蛋白至少有九類[12，13，14]。如表1所示。命名法（表1中以粗體顯示）基于運動蛋白結(jié)構(gòu)域在驅(qū)動蛋白中的位置，因此N-蛋白在蛋白的氨基末端含有運動結(jié)構(gòu)域，而C-和M-運動蛋白分別位于蛋白的羧基末端和中間[12]。
Cytoskeley提供的重組驅(qū)動蛋白已被設(shè)計為結(jié)合運動結(jié)構(gòu)域，包括頸部區(qū)域和大部分柄結(jié)構(gòu)域，這些構(gòu)建體被設(shè)計為產(chǎn)生正常的二聚體結(jié)構(gòu)，盡管這尚未通過沉淀分析進(jìn)行測試。在給定類別的驅(qū)動蛋白中，約340個氨基酸的運動區(qū)的同源性可以在N-1類（最高度保守的囊泡運輸運動）的74-81%同一性和C類（最發(fā)散的）的46-50%同一性之間變化[13]。類之間的同一性百分比下降到35-40%[13]左右。對現(xiàn)有運動數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)比較表明，不同驅(qū)動蛋白類別的運動之間存在顯著的構(gòu)象變異，結(jié)構(gòu)差異集中在六個區(qū)域，其中大多數(shù)在微管結(jié)合或?qū)⒑诵倪\動與柄區(qū)連接方面具有重要的功能[9，11]。考慮到不同驅(qū)動蛋白類別的馬達(dá)之間相對較高的百分比差異，很可能會確定類別特異性驅(qū)動蛋白藥物。這一結(jié)構(gòu)證據(jù)得到了生物化學(xué)數(shù)據(jù)的支持，這些數(shù)據(jù)表明，不同種類的果蠅驅(qū)動蛋白對各種ATP類似物的利用不同[15]。考慮到ATP結(jié)合口袋是運動結(jié)構(gòu)域中最高度保守的區(qū)域之一，這一點令人印象深刻[9]。這些實驗表明，即使在給定的物種內(nèi)，驅(qū)動蛋白類別之間也存在明顯的結(jié)構(gòu)差異，可以用于選擇性藥物開發(fā)。在這方面，令人鼓舞的是，我們已經(jīng)能夠在HTS測定中檢測驅(qū)動蛋白之間的類似物特異性（見I期報告）。因此，我們相信，我們將能夠檢測出具有潛在抗癌藥物用途的類特異性化合物。
*大膽的分類系統(tǒng)取自Hirokawa[12]。括號中的分類系統(tǒng)在文獻(xiàn)中經(jīng)常使用，取自Moore和Endow[14]。
**An，巢狀曲霉：Hs，智人：Dm，黑腹果蠅。
黃色/綠色陰影表示僅在細(xì)胞分裂中起作用的驅(qū)動蛋白類別，淺黃色陰影表示包含在細(xì)胞分裂或有絲分裂中起功能的驅(qū)動素類別，未陰影區(qū)域表示僅參與囊泡運輸?shù)尿?qū)動肽。
尋找潛在的抗真菌藥物需要我們識別一類驅(qū)動蛋白內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，如上所述，運動區(qū)域在任何給定類別的驅(qū)動蛋白中的變化都小于類別之間的變化。在這方面有兩點值得注意；首先，我們的主要真菌靶標(biāo)是BimC蛋白，它屬于最多樣化的驅(qū)動蛋白類，在運動區(qū)內(nèi)表現(xiàn)出約47%的同一性（任何低于60%的同一度都被認(rèn)為是可接受的差異靶標(biāo)特異性），其次，我們在重組蛋白靶標(biāo)中包括了高度可變的柄區(qū)（見實驗方法），它提供了相對蛋白質(zhì)特異性的靶標(biāo)（<20%同一性）[13]。重要的是，對柄區(qū)的抗體抑制已被證明可抑制體內(nèi)運動功能[16]。
用于HTS測定的Kinesin靶點的選擇
驅(qū)動蛋白的細(xì)胞功能可分為兩大類；膜囊泡和細(xì)胞器的運輸和定位，以及有絲分裂紡錘體的形態(tài)發(fā)生和染色體運動[12]。一類驅(qū)動蛋白在功能上有許多相似之處，這并不奇怪。從表1中可以看出，九類驅(qū)動蛋白運動中有四類專門參與細(xì)胞分裂（表1的黃色/綠色陰影區(qū)域），兩類（C-和M-）同時含有囊泡轉(zhuǎn)運蛋白和有絲分裂運動（表1中的淺黃色陰影區(qū)域）；三類（N-I、NIII和N-IV）專門參與囊泡轉(zhuǎn)運（表1未陰影區(qū)域）。
我們從每一類驅(qū)動蛋白[6，17，21，22，26，28，29，30，39]中選擇了一種人類同源物，并從人類病原體曲霉菌中選擇了兩種真菌驅(qū)動蛋白[34]，作為HTS測定的基礎(chǔ)（如表1所示）。通過用化合物文庫篩選每種蛋白質(zhì)，可以生成一個初級數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫將允許鑒定選擇性靶向細(xì)胞分裂特異性類人驅(qū)動蛋白的化合物（表1的深色陰影區(qū)域），同時對囊泡運輸驅(qū)動蛋白沒有影響。這類化合物最有可能是治療人類疾病如癌癥的有效抗有絲分裂劑。同樣，與驅(qū)動素曲霉菌特異性反應(yīng)的化合物可以作為潛在的抗真菌藥物進(jìn)行研究。
Kinesins作為有效的抗有絲分裂靶點
在開始一項昂貴的藥物發(fā)現(xiàn)計劃之前，必須嚴(yán)格評估所提出的蛋白質(zhì)是否符合有效藥物靶點的標(biāo)準(zhǔn)。驅(qū)動蛋白將成為抗有絲分裂藥物開發(fā)的優(yōu)秀靶點的證據(jù)來自一系列實驗方法，包括突變分析[40]、抗體抑制實驗[7，32]和驅(qū)動蛋白活性的反義抑制[19]。表1總結(jié)了這一證據(jù)，其中可以看出，對給定的有絲分裂特異性驅(qū)動蛋白的功能性抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂的抑制。例如，通過向HeLa細(xì)胞中微量注射抗-Eg5抗體對HsEg5的體內(nèi)抑制導(dǎo)致>80%的細(xì)胞停止有絲分裂。使用過表達(dá)的HsEg5運動結(jié)構(gòu)域突變體證實了這些結(jié)果[7]。在另一組實驗中，人類細(xì)胞系中無運動CENP-E蛋白的體內(nèi)過表達(dá)導(dǎo)致染色體在中期板上排列失敗，并導(dǎo)致有絲分裂阻滯[22]。此外，向HeLa細(xì)胞微量注射CENP-E抗體也會導(dǎo)致持續(xù)4至17小時的有絲分裂阻滯，并導(dǎo)致所有細(xì)胞進(jìn)入凋亡[22]。由于這兩種蛋白質(zhì)都包含在我們的HTS測定中，我們非常希望針對這些馬達(dá)的化合物具有治療相關(guān)性。有趣的是，N-V類驅(qū)動蛋白（表1）含有與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤有關(guān)的人類驅(qū)動蛋白[5]。這種運動的非洲爪蟾同源物的反義和抗體抑制導(dǎo)致有絲分裂阻滯和細(xì)胞死亡[19]這一事實令人鼓舞，表明靶向人類促色蛋白的藥物可能在治療/預(yù)防視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤方面有用。
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